En su trayectoria científica se pueden distinguir tres etapas. La primera, que coincide con su juventud, estuvo especialmente dedicada a las exploraciones del suelo pampeano y a estudios sobre la antigüedad del hombre en América. Se puede decir que en este período, que abarca desde 1875 a 1882, Ameghino fue un antropólogo.

La segunda etapa es la más trascendente de su producción científica. Vuelto de Europa con un gran caudal de conocimientos -adquiridos de sus colegas, y en los museos de París, Bruselas y Londres-, y con el material que provenía de los viajes expedicionarios de su hermano Carlos a la Patagonia, Ameghino fue realizando un monumental estudio de cientos de fósiles, que interpretaba a la luz del evolucionismo darwiniano, aún cuando esta teoría no se hallaba   firmemente establecida entre los naturalistas. Son también estos los años en los que más sufre y más lucha contra la pobreza; financia sus emprendimientos con las ganancias de una modesta librería y sólo en 1903, cuando prácticamente había completado su obra, recibió la primera designación duradera del Estado. Cierra esta etapa de su vida en 1906 con Formaciones sedimentarias del Cretáceo Superior y del Terciario de Patagonia, una obra de síntesis que no se limita a las descripciones, sino que plantea hipótesis sobre la evolución de los diversos mamíferos y analiza las distintas capas de la corteza terrestre y sus posibles edades.

Finalmente, entre 1907 y 1911, vuelve Ameghino a su primitiva dedicación: el hombre fósil, las descripciones de los primeros habitantes, sus industrias y culturas.

Impresiona el volumen que alcanzaron sus publicaciones en los 57 años que vivió. En una recopilación, publicada como Obras Completas, se cuentan 24 volúmenes de entre 700 y 800 páginas cada uno, que contienen clasificaciones, estudios, comparaciones y descripciones de más de 9000 animales extinguidos, muchos de ellos descubiertos por él. Tal importante era este catálogo en relación con la cantidad total de mamíferos extinguidos conocidos en el mundo entero, que científicos de América y Europa viajaban a la Argentina a conocer la "colección de Ameghino", excépticos y curiosos, para rendirse por fin, ante la evidencia de la verdad y el genio del naturalista.

De su vida se sabe bastante, gracias a la somera reseña autobiográfica que realizó (Ver Autobiografía): Es muy probable que haya nacido en Luján, (Buenos Aires), en setiembre de 1853. Sin embargo algunos historiadores ponen en duda este dato y creen posible que Génova, Italia, sea su lugar de nacimiento. De todas maneras vivió, se formó y desarrolló su labor científica en Argentina.

Su formación primaria la realizó en forma particular y como entretenimiento infantil recogía huesos en las barrancas de Luján. En Buenos Aires siguió estudios secundarios que no concluyó y enseguida se trasladó a la localidad bonaerense de Mercedes, donde fue maestro, director de una escuela y dedicó nueve meses al estudio geológico y paleontológico de los terrenos de la llanura pampeana.

En 1875 dio a conocer las primeras especies nuevas que había descubierto. En el mismo año, se presentó en un concurso-exposición organizado por la Sociedad Científica con siete cajas de fósiles. Pero a los jurados poco les interesaban aquellas reliquias y sólo las premiaron con la última de las catorce menciones honoríficas. Ameghino insistió al año siguiente con una memoria sobre el cuaternario -la más reciente era geológica- que ni siquiera fue considerada.

La Exposición Internacional de París de 1878 es adonde lleva luego su ya crecida colección de fósiles. En Europa siguió cursos, visitó museos, se relacionó con importantes científicos y pudo publicar La antigüedad del hombre en el Plata y Los Mamíferos fósiles en la América Meridional, que se traduciría más tarde al francés. En 1884 publicó Filogenia, una obra teórica en la que desarrolla su concepción evolucionista, de neto corte lamarckiano, y propicia, con intuición precursora, la fundación de una taxonomía zoológica de fundamentos matemáticos.

En 1886, Francisco P. Moreno lo nombró vicedirector del Museo de La Plata, asignándole la sección de paleontología, que Ameghino enriqueció con su propia colección. Pero fue poco el tiempo en que estos dos científicos trabajaron juntos y la Cátedra de Zoología de la Universidad de Córdoba fue el inmediato destino de Ameghino desde 1888. Un año después presentó en las Actas de la Academia Nacional de Ciencias su obra magna, compuesta por 1028 páginas y un atlas: Contribución al conocimiento de los mamíferos fósiles de la República Argentina.

Cuando se estaba desempeñando como profesor de mineralogía y geología en La Plata, fue convocado para hacerse cargo de la dirección del Museo Nacional de Historia Natural de Buenos Aires, en reemplazo de Germán Burmeister, quién fuera su gran oponente intelectual, y de Carlos Berg. Con la dirección de Ameghino, que contaba con un muy bajo presupuesto, el museo consiguió acrecentar notablemente su material.

Desde las primeras publicaciones de Ameghino, se despertó en el extranjero, sobre todo en los Estados Unidos, la curiosidad por observar directamente y poder coleccionar los fósiles de mamíferos patagónicos. Así, en distintas épocas, destacados hombres de ciencia recorrieron nuestro país y produjeron importantes trabajos.

Otro aspecto de su obra está representado por las construcciones teóricas y doctrinarias, con las que estructuró todas sus observaciones y descubrimientos, y que aparecen en Mi Credo, la concepción del universo según un filósofo científico y en Los Infinitos.

Por muchos años, defendió con pasión una tesis errónea, algo que no desacreditó su excepcional trayectoria. Supuso que el hombre se había originado en América y que el suelo argentino, o algún territorio próximo a él, fue la cuna de nuestra especie, de manera que las migraciones humanas que poblaron los demás continentes arrancaron desde aquí y pasaron a través de puentes hoy inexistentes. Ameghino puso al servicio de esta doctrina antropológica todos sus hallazgos.

Estas ideas implicaban la adhesión a la teoría de la evolución, aún no aceptada en aquella época por todos los naturalistas: Ameghino fue el gran introductor del darwinismo en la Argentina.

Esta obra se basa en las colecciones comenzadas con las expediciones anuales de Carlos Ameghino a la Patagonia, allá por 1887. En un singular trabajo de colaboración, año tras año Carlos enviaba a su hermano documentación minuciosa sobre las sucesivas faunas extinguidas que la naturaleza había preservado en los suelos de Chubút, Neuquén, Santa Cruz y Río Negro, Entonces, en la trastienda de su comercio de librería, Florentino Ameghino fue realizando un estudio sistemático de esos cientos de fósiles, que interpretaba a la luz del evolucionismo. George Gaylord Simpson, uno de los fundadores de la "Teoría Sintética de la Evolución", calificó esta empresa como "uno de los más notables logros en la historia de la ciencia."

Es así que su obra alcanza visos de genialidad. No sólo por su volumen y amplitud (hizo estudios antropológicos, paleontológicos y geológicos) sino por formar parte de un enfoque integrado, que le permitió realizar una reconstrucción paleogeográfica del continente y de las migraciones de animales extinguidos a lo largo del tiempo geológico. Además, realizó trabajos sobre el lenguaje (en El origen poligénico del lenguaje, de 1910), propuso un nuevo sistema de escritura taquigráfica, que él mismo utilizaba para tomar notas (Taquigrafía, de 1880), y analizó los problemas ambientales, en trabajos tales como Las sequías e inundaciones de la Provincia de Buenos Aires, de 1884, un trabajo que actualmente es objeto de culto entre los climatólogos.

Florentino Ameghino murió en La Plata, en 1911, en medio de una atmósfera de generalizado reconocimiento a su labor y a su figura. Ese mismo reconocimiento que le había faltado en la época de oro de su trabajo científico.