En enero de 1580 Juan de Garay comenzó los preparativos de la segunda fundación de Buenos Aires. Se pretendía poblar la nueva ciudad con gente de Asunción, para lo cual se promulgó un bando ofreciendo tierras y otras mercedes. Se apuntaron 200 familias guaraníes y 76 de colonos. Se llevó todo lo necesario por el río en la carabela Cristóbal Colón y dos bergantines entre otras naves menores, expedición que salió el 9 de marzo del mismo año. Además de los colonos iban 39 soldados.
Juan de Garay después de conocer toda clase de penurias se unió a algunas expediciones de exploración y de conquista, y acompañó a Núñez de Prado en la población del valle de Tarja.
Volvió a ese lugar con los compañeros de Andrés Manso, que quería poblar un trozo de tierra a espaldas de Charcas. En esa oportunidad conoció a Nufrio de Chávez, que había cruzado el Chaco desde Asunción del Paraguay con miras a la fundación de una provincia independiente. Chávez apresó a Manso y lo remitió a Charcas, de donde escapó y volvió a los llanos de Guapay. Los indios lo mataron en 1564 y Nufrio de Chávez quedó dueño único de aquellas regiones. Garay se encontró en la fundación de Santa Cruz de la Sierra por Nufrio de Chávez en 1561, fue uno de los primeros encomenderos de la misma y miembro de su cabildo.
En 1563 Nufrio de Chávez se dirigió a Asunción, y se encontró allí en febrero de 1564. Hizo tan entusiastas relatos de las posibilidades que había para los españoles en las regiones próximas a la cordillera que en octubre salió de Asunción un verdadero éxodo de vecinos, el gobernador interino Francisco Ortiz de Vergara, el obispo Pedro Fernández de la Torre, 150 españoles, 30 mestizos, varios centenares de indios y ochenta caballos. Cuando la expedición llegó a Santa Cruz de la Sierra, conoció Garay a Isabel Becerra, que iba en la comitiva y se casó con ella; en Santa Cruz nacieron sus primeros hijos.
Juan de Garay
Frustradas las ilusiones que habían hecho nacer la fantasía o el interés de Nufrio de Chávez, Felipe de Cáceres, teniente de gobernador de Juan Ortiz de Zárate, comisionó en febrero de 1568 a Juan de Garay para que condujese a Asunción nuevamente a la gente que había llegado con Nufrio de Chávez y Ortiz de Vergara. En diciembre de ese año llegó al punto de destino; entretanto Nufrio de Chávez había sido muerto por los indios en una emboscada.
Asistió Garay como espectador a las interminables disputas entre el obispo Fernández de la Torre y el gobernador Felipe de Cáceres, hasta que éste fue apresado, cargado de cadenas y enviado a España; los extremos de la cadena llegaban para mayor seguridad al aposento donde dormía el obispo, su carcelero en el viaje.
Martín Suárez de Toledo encomendó a Garay la fundación de una ciudad sobre el río Paraná y éste cumplió el encargo con todo éxito el 15 de noviembre de 1573, al formalizar la fundación de Santa Fe en nombre del adelantado Juan Ortiz de Zárate y con poderes de su teniente de gobernador.
Muerto Ortiz de Zárate, su sobrino Diego de Mendieta pensó más en divertirse a su modo que en los problemas del gobierno que había quedado a su cargo. Por eso encomendó a Juan de Garay que se trasladase a Charcas en busca de Juana Ortiz de Zárate, su prima, a fin de que residiese en el Río de la Plata. Garay partió de Santa Fe en marzo de 1576 y fue retenido en Santiago del Estero por el gobernador Gonzalo de Abreu; regresó luego a Santa Fe y volvió a emprender viaje en enero de 1577; en Santiago del Estero tuvo que auxiliar con su gente a Abreu en la fundación de San Clemente de la Nueva Andalucía, en el valle de Salta, y poco después logró seguir viaje directamente a Charcas. Juana Ortiz de Zárate, heredera de la gobernación del Río de la Plata, se había casado con el licenciado Juan Torres de Vera y Aragón, desairando a muchos otros pretendientes. Torres de Vera y Aragón, nacido en Estepa, España, en 1506, fue designado en 1536 para regentear la junta de la audiencia de Chile; gobernó militar y civilmente a Chile durante cinco años por encargo del gobernador Miguel Velasco; en 1574 pasó a la audiencia de Charcas y allí se casó con Juana Ortiz de Zárate, en virtud de cuyo matrimonio se convertía en adelantado del Río de la Plata. Tuvo numerosos pleitos por esa causa, pleitos que retardaron muchos arios su llegada al territorio de su jurisdicción. En vista de esas trabas, encargó a Garay, como su teniente de gobernador, que poblase en su nombre el puerto de Buenos Aires.
En abril de 1578 salió Garay de Charcas con la orden fundadora de Torres de Vera y Aragón, llegó a Santa Fe en junio y a mediados de agosto se puso en viaje para Asunción. Hizo una salida con hombres de armas contra los indios del Alto Paraguay que se habían sublevado y anunció en enero de 1580 el mandato que tenía para poblar una ciudad sobre el Río de la Plata.