El incentivo para la concurrencia de pobladores no era ya el oro y la plata, sino el ganado silvestre, los caballos en cantidades incalculables que cubrían la pampa. Se alistaron 66 personas, todas a su cargo, con armas, caballos y ganados. Una sola mujer, Ana Díaz, se atrevió a participar en esa jornada.
El incentivo para la concurrencia de pobladores no era ya el oro y la plata, sino el ganado silvestre, los caballos en cantidades incalculables que cubrían la pampa. Se alistaron 66 personas, todas a su cargo, con armas, caballos y ganados. Una sola mujer, Ana Díaz, se atrevió a participar en esa jornada.
De ese contingente fundador, 10 eran españoles peninsulares, los demás hijos de la tierra, mestizos. Había un portugués, Antonio Tomás, que había asistido a la primera fundación por Pedro de Mendoza, y acompañó a los expedicionarios Juan de Rivadeneyra, que se trasladaba a España en busca de religiosos para sus misiones.
Los viejos y nuevos pobladores de Asunción hacían revivir a Buenos Aires después de 39 años de despoblamiento, en el momento en que, si no por esa iniciativa, habría sido asentada por imposición misma de la expansión natural de la gobernación del Tucumán o de la de Chile.
Primer plano de la fundación de Buenos Aires desarrollado por Garay
La flotilla se componía de la carabela San Cristóbal, dos bergantines, balsas y canoas de los indios. Los núcleos se reunieron en Santa Fe y en mayo prosiguieron la marcha. La gente que iba por tierra con caballos acrecentó su número con algunos criollos y con Alonso de Vera, el sobrino del adelantado, a quien llamaron "Cara de perro". Los bergantines al mando de Garay se hallaron el 29 de mayo frente al sitio en que iba a asentarse la ciudad.
La ceremonia de la fundación se cumplió el 11 de junio de 1580, después de haber limpiado lo que habría de ser plaza Mayor. Se proclamó en ese acto que se procedía en cumplimiento de lo capitulado por Juan Ortiz de Zárate y en nombre de su sucesor, el adelantado Juan Torres de Vera y Aragón, que lo hacía a su vez por el rey don Felipe.
Se bautizó la nueva fundación con el nombre de Santísima Trinidad; fueron nombrados alcaldes ordinarios Rodrigo Ortiz de Zárate y Gonzalo Martel de Guzmán y regidores Pedro de Quirós, Diego de Olavarrieta, Antonio Bermúdez, Luis Gaitán,. Rodrigo de Ibarrola y Alonso de Escobar. Terminadas las ceremonias y los juramentos de estilo, se trasladaron todos a la plaza pública que había sido desbrozada al efecto, clavaron un palo y madero por rollo público y concejil para que sirviera de árbol de justicia.
Poco después partió fray Juan de Rivadeneyra en la carabela San Cristóbal de Buenaventura, que informó al rey de la fundación hecha por Garay.
La ciudad fue dividida en 250 manzanas, de las cuales 40 se destinaban a población, 6 al fuerte, plaza Mayor, a tres conventos y a un hospital. Fuera de ese perímetro, Garay dio a cada uno de los pobladores una huerta de 4 manzanas. El cabildo eligió a suerte como patrono de la ciudad a San Martín de Tours y el propio Garay diseñó el escudo de armas y blasón de la ciudad: un águila negra con su corona en la cabeza, con cuatro aguiluchos debajo demostrando que los cría y una cruz roja semejante a la de Calatrava sobre un campo blanco.
El 24 de octubre repartió tierras desde la parte norte del ejido hasta más allá del actual San Isidro, más 29 suertes desde el Riachuelo hasta lo que después se llamó Pago de la Magdalena.
Cumplidos esos requisitos, Garay volvió a Santa Fe, donde tuvo conocimiento del motín que hubo en su ausencia, el 1 de junio, encabezado por siete mestizos de Asunción y que fue prontamente sofocado. Embarcó para Buenos Aires en la cuaresma con algunos nuevos pobladores y un clérigo.
La leyenda de una ciudad de indios y españoles en la cordillera o en el fondo de la Patagonia sedujo a muchos conquistadores y no dejó de atraer también a Garay y a sus hombres. Pasada la Pascua organizó una expedición compuesta de unos 30 hombres para salir en busca de la ciudad fabulosa. Llegó hasta un lugar que se identifica como Mar del Plata y regresó a Buenos Aires sin haber dado con la ciudad de los Cesares.
En marzo de 1582 distribuyó entre los vecinos a los indios de los alrededores de Buenos Aires; marchó después a Asunción y logró imponer un poco de orden en las costumbres de criollos y mestizos.
Como medida de emergencia autorizó a los vecinos que tuvieran hijas en sus casas la muerte de cualquier hombre que encontrasen en sus habitaciones o corrales, indicio del estado de desenfreno a que se había llegado.
Regresó a Buenos Aires a principios de diciembre, pero se detuvo hasta febrero de 1583 con su familia en Santa Fe. Estando allí se le presentó Alonso de Sotomayor, que había sido nombrado gobernador de Chile y había desembarcado de la armada de Flores Valdés, en Buenos Aires, en enero.
Según detalla Hialmar Gammalsson en Los Pobladores de Buenos Aires y su descendencia, el estudio más completo realizado sobre la fundación de Garay, éstos fueron los primeros sesenta y cinco pobladores (en la referencia respecto del origen debe leerse "paraguayos" como nacidos en Asunción y "americanos" como criollos, sin mayor precisión):