El 9 de marzo de 1583 Garay se embarcó en Buenos Aires con algunos de los hombres del nuevo gobernador de Chile, don Alonso de Sotomayor. Con rumbo a Santa Fe, en un bergantín con unos cincuenta hombres. A poca distancia del lugar en que estuvo emplazado el fuerte Sancti Spiritu fundado por Gaboto, Garay bajó a tierra con parte de la tripulación, a fin de no dormir incómodamente a bordo de la pequeña embarcación. Seguro del respeto que le tenían los indios no dejó guardia ni centinela. Esa improvisación le fue fatal: los “indios del lugar” atacaron a los dormidos españoles y dieron muerte a Garay y a doce de sus acompañantes
En vista de las dificultades habidas en el viaje, resolvió hacer la travesía a Chile por tierra, tomando el camino de Carcarañá. Garay lo auxilió en lo que pudo, le vendió 300 caballos y pocos días después se dirigió a Buenos Aires para acompañar al hermano del gobernador de Chile, Luis de Sotomayor, hasta el Carcarañá, desde donde debía seguir a su destino.
El 9 de marzo escribió su última carta al rey desde Buenos Aires y al día siguiente embarcó en un bergantín con unos cincuenta hombres, mientras Luis de Sotomayor y el capitán Francisco Cuevas hacían el trayecto por tierra.
En la creencia de que acortaban camino, entró en un riacho o laguna, pero no halló salida y, como ya se hiciera tarde, resolvió pasar la noche en el lugar, donde unos 40 indios observaban semiocultos. Los hombres de Garay se echaron a dormir tranquilamente y los indios cayeron sobre ellos de improviso armados de macanas, mataron a Juan de Garay y a otros doce españoles, se llevaron a otros diez más, a un fraile franciscano y a una mujer e hirieron a unos treinta que apenas pudieron salvarse en el bergantín y llegar a Santa Fe con la noticia del desastre. El lugar donde fue muerto Garay es la confluencia del río Coronda con el Carcarañá, a corta distancia del antiguo fuerte de Sancti Spiritus.
Los indios de la zona fueron castigados rudamente, primero por Luis de Sotomayor, cuando se enteró de lo ocurrido al llegar a Carcarañá; luego por Rodrigo Ortiz al volver de Asunción, y por Torres Pineda, que había quedado en Buenos Aires como teniente de Garay.
Torres de Vera y Aragón nombró sucesor de Garay a Juan de Torres Navarrete, que se hizo cargo del gobierno de Asunción en marzo de 1584.
El fundador de Santa Fe y Buenos Aires dejó mucha descendencia que figuró en el período colonial; Jerónima de Contreras, una hija, se casó con Hernandarias de Saavedra; María Garay, casada en primeras nupcias con Gonzalo Martel de Cabrera, de Córdoba, se casó luego con Pedro García Arredondo, teniente de gobernador de Buenos Aires; Juan de Garay, hijo, se casó con una hija de Martín Suárez de Toledo; Tomás de Garay fue regidor de Asunción y Buenos Aires y procurador del Río de la Plata.
La muerte de Garay el 25 de marzo de 1584, óleo de J García Bañon