Luego del motin de las trenzas Belgrano continuó como jefe del Regimiento de Patricios y para recomponer la disciplina, el regimiento fue enviado a Rosario a vigilar el río Paraná contra avances de los realistas de Montevideo y preparar dos baterías defensivas.
Allí, en Rosario, a las orillas del río Paraná, el 27 de febrero de 1812 enarboló por primera vez la bandera argentina, creada por él con los colores de la escarapela, también obra suya. Lo hizo ante las baterías de artillería que denominó "Libertad" e "Independencia", donde hoy se ubica el Monumento Histórico Nacional a la Bandera. Inicialmente, la bandera era un distintivo para su división del ejército, pero luego la adoptó como un símbolo de independencia.
Esta actitud le costó su primer enfrentamiento abierto con el gobierno centralista de Buenos Aires, personificado en la figura del ministro Bernardino Rivadavia, de posturas netamente europeizantes.
El Triunvirato reaccionó alarmado: la situación militar podría obligar a declarar una vez más la soberanía del rey Fernando VII de España, de modo que Rivadavia le ordenó destruir la bandera. Sin embargo, Belgrano la guardó y decidió que la impondría después de alguna victoria que levantara los ánimos del ejército y del Triunvirato.
En cuanto a su elección de los colores de la bandera nacional argentina, tradicionalmente se ha dicho que se inspiró en los colores del cielo; esta versión es sin dudas válida aunque no excluyente de otras. Sin embargo, es muy probable que haya elegido los colores de la dinastía borbónica (el azul-celeste y el 'plata' o blanco) como una solución de compromiso: en sus momentos iniciales las Provincias Unidas del Río de la Plata, para evitar el estatus de rebelde declararon que rechazaban la ocupación realista, aunque mantenían aún fidelidad a los Borbones. Por otra parte, Belgrano parece haber sido devoto de la Virgen de Luján, y otras advocaciones de la Virgen (de Chaguaya, de Itatí, del Valle, de Cotoca, y de Caacupé), cuyas vestes tradicionalmente son o han sido albicelestes; en rigor ninguna de las teorías se contradice ya que los colores del cielo representan al manto de la Inmaculada Concepción de La Virgen cuyos colores fueron elegidos por la dinastía borbónica de la Corona de España para su presea más importante entonces otorgada: la Orden de Carlos III, de esta presea o condecoración surgió luego durante las Invasiones Inglesas la escarapela y penacho del Regimiento de Patricios.
Pintura de Belgrano tomando juramento a las tropas en las barrancas del río Paraná en 1812. Óleo sobre tela. Autor: Rafael del Villar. Fecha de ejecución: 1947.