Luchó en la Cruzada Libertadora que se inició con el desembarco de los Treinta y Tres. En 1839 fue nombrado por los colorados jefe político del departamento de San José. Luchó en la Guerra Grande contra Manuel Oribe y Juan Manuel de Rosas (1843-1851) y participó en la batalla de Cagancha. Al inicio del Sitio Grande fue designado comandante militar, convirtiéndose luego en un influyente personaje en el Partido Colorado.
Con el final de la Guerra Grande el presidente sería el general Eugenio Garzón, pero su fallecimiento hizo que se eligiera a Juan Francisco Giró, siendo Flores nombrado jefe político de Montevideo en 1852. En 1853, cuando renunció Giró, Flores formó un «triunvirato» con Fructuoso Rivera y Juan Antonio Lavalleja. Con el fallecimiento de estos, en 1853 y 1854, Flores quedó en ejercicio del Poder Ejecutivo.
Verificadas nuevas elecciones, el 12 de marzo de 1854 la Asamblea General lo eligió presidente constitucional hasta el 1 de marzo de 1856, para completar el período del presidente Giró. Sin embargo, en agosto de 1855 se produjo una revolución militar contra el presidente, quien abandonó la capital. Los sublevados instauraron un gobierno provisional presidido por don Luis Lamas. Se logró un acuerdo entre las partes a fin de evitar un enfrentamiento militar y el conflicto terminó pacíficamente. Flores reunió a la Asamblea General, disuelta por los revolucionarios y el 10 de septiembre de 1855 presentó su renuncia indeclinable del cargo presidencial, sucediéndole en el ejercicio del Poder Ejecutivo el Presidente del Senado, don Manuel B. Bustamante. Los revolucionarios aceptaron al nuevo gobernante interino y depusieron las armas.
En 1856 se radicó en la provincia de Entre Ríos (Argentina), interviniendo activamente en la Confederación Argentina y del Uruguay, apoyando al centralista Estado de Buenos Aires (gobernado por los unitarios). El 22 de noviembre de 1861, al mando de las tropas del unitario Bartolomé Mitre, fue el responsable de la Matanza de Cañada de Gómez (en la provincia de Santa Fe), en la que sorprendió al ejército federal en el medio de la noche e hizo degollar a más de 300 hombres del ejército federal. Los que no fueron asesinados en esa noche fueron incorporados al ejército de Mitre, pero desertaron en la primera ocasión. Por lo tanto, en adelante, Flores haría degollar a todo prisionero federal que cayera en sus manos.
El 19 de abril de 1863 encabezó una revolución que dio inicio a una guerra civil, que él bautizó «Cruzada Libertadora». Venció a los nacionalistas uruguayos en la batalla de Coquimbo (junio de 1863) y Cañas (julio de 1863). En ese mes cometió traición a su patria cuando aceptó la ayuda militar del Imperio de Brasil ―que había declarado la guerra a Uruguay (gobernado por Bernardo Prudencio Berro)― y de los unitarios de Buenos Aires, Flores ocupó Florida el 4 de agosto de 1864, e hizo fusilar a los defensores de la villa (hoy ciudad, capital del departamento homónimo). En enero de 1865 tomó Paysandú, sitiada por los brasileños (véase el artículo Defensa de Paysandú) y mandó fusilar a todos los oficiales. El 20 de febrero de 1865 entró en Montevideo.
Asumió la jefatura del Estado Uruguayo con el título de «Gobernador Provisorio» durante tres años. En marzo de 1865 se involucró ―conjuntamente con el Imperio de Brasil y los unitarios de Buenos Aires, en la Guerra de la Triple Alianza contra Paraguay.
Ejerciendo el cargo provisorio se aprobó el Código de Comercio en 1866. En 1867 se realizó la primera conexión telegráfica con Buenos Aires y se inauguró el edificio central de la Administración del Correo. Al año siguiente se aprobó el Código Civil y se inauguró la primera línea de tranvías de tracción a caballo. Otro logro de su gobierno fue el otorgamiento de las primeras concesiones para la construcción de las líneas de ferrocarriles.
El gobierno de Venancio Flores terminó el 15 de febrero de 1868. Cuatro días después, y en circunstancias largamente discutidas, fue asesinado en Montevideo por un grupo de desconocidos.
La Ley Nº 1854 del 30 de diciembre de 1885 promulgada durante el gobierno de Máximo Santos crea en su memoria el departamento de Flores.