Sus padres fueron Alfonso Storni y Paulina Martignoni, quienes junto a sus hermanos mayores, María y Romero, llegaron a la provincia de San Juan desde Lugano, Suiza, en 1880. Fundaron una pequeña empresa familiar, y años después, las botellas de cerveza etiquetadas «Cerveza Los Alpes, de Storni y Cía», comenzaron a circular por toda la región.
En 1891 la familia viajó a Suiza, quedando en San Juan los hermanos mayores. El 22 de mayo de 1892 nació Alfonsina en la aldea Sala Capriasca, 8 km al norte de la ciudad de Lugano, siendo la tercera hija del matrimonio Storni-Martignoni. Su padre, un hombre «melancólico y raro», fue quien eligió el nombre. Años más tarde, Alfonsina le diría a su amigo Fermín Estrella Gutiérrez (1900-1990): «Me llamaron Alfonsina, que quiere decir ‘dispuesta a todo’». Hay otras versiones que indican que nació el 22 de mayo pero la registraron el 29 y otras que afirman que nació en un barco en altamar.
Fue bautizada en la parroquia de Tesserete, la aldea contigua a Capriasca, lugar en el que actualmente se puede leer en el margen del acta de bautismo una inscripción realizada por el sacerdote Osvaldo Crivelli que dice: «Grande poetesa morta al mar della Plata».
Alfonsina aprendió a hablar en italiano, y en 1896 regresó a San Juan, de donde son sus primeros recuerdos.
Estoy en San Juan, tengo cuatro años; me veo colorada, redonda, chatilla y fea. Sentada en el umbral de mi casa, muevo los labios como leyendo un libro que tengo en la mano y espío con el rabo del ojo el efecto que causo en el transeúnte. Unos primos me avergüenzan gritándome que tengo el libro al revés y corro a llorar detrás de la puerta.
Su madre la anotó en el jardín de infantes, donde se la recuerda como una chica curiosa y que hacía muchas preguntas, imaginaba mucho y mentía. Su madre tenía dificultades para enseñarle a decir la verdad. Inventaba incendios, robos, crímenes que nunca aparecían en los policiales de los periódicos, metía a su familia en líos y en una oportunidad invitó a sus docentes a pasar las vacaciones a una quinta imaginaria en las periferias de la ciudad.
En 1896, volvieron a Argentina junto con Alfonsina, quien había nacido durante la estancia de la pareja en el país europeo. En San Juan, concurrió al jardín de infantes y desarrolló la primera parte de su niñez. A principios del siglo XX la familia se mudó a Rosario (provincia de Santa Fe), donde su madre fundó una escuela domiciliaria y su padre instaló un café cerca de la estación de ferrocarril Rosario Central. Alfonsina se desempeñó como mesera en el negocio familiar, pero dado que este trabajo no le gustaba se independizó y consiguió empleo como actriz. Más tarde recorrería varias provincias en una gira teatral
Storni Martignoni ejerció como maestra en diferentes centros educativos, y escribió sus poesías y algunas obras de teatro durante este período. Su prosa es feminista y, según la crítica, posee una originalidad que cambió el sentido de las letras de Latinoamérica. Otros dividen su obra en dos partes: una de corte romántico, que trata el tema desde el punto de vista erótico y sensual y muestra resentimiento hacia la figura del varón, y una segunda etapa en la que deja de lado el erotismo y aborda el tema desde un punto de vista más abstracto y reflexivo. La crítica literaria, por su parte, clasifica en tardorrománticos a los textos editados entre los años 1916 y 1925, y a partir de Ocre encuentra rasgos de vanguardismo y recursos como el antisoneto (soneto en verso blanco). Sus composiciones reflejan, además, la enfermedad que padeció durante gran parte de su vida y muestran la espera del punto final de su vida, expresándolo mediante el dolor, el miedo y otros sentimientos.
Fue diagnosticada con cáncer de mama, del cual fue operada. A pedido de un medio periodístico se realizó un estudio de quirología, cuyo diagnóstico no fue acertado. Esto la deprimió, provocándole un cambio radical en su carácter y llevándola a descartar los tratamientos médicos para combatirla.
Se suicidó en Mar del Plata arrojándose de la escollera del Club Argentino de Mujeres. Alfonsina consideraba que el suicidio era una elección concedida por el libre albedrío, y así lo había expresado en un poema dedicado a su amigo y amante, el también escritor suicida Horacio Quiroga. Hay versiones románticas que dicen que se internó lentamente en el mar; algunas de esas versiones sirvieron para componer la canción «Alfonsina y el mar», basada enteramente en como se suicidó Alfonsina. Su cuerpo fue velado inicialmente en Mar del Plata y finalmente en Buenos Aires. Actualmente sus restos se encuentran enterrados en el cementerio de la Chacarita.