Tras recibir su educación en el Colegio de San Luis de los Franceses de Madrid, estudió, a partir de 1885, arte dramático con la actriz Teodora Lamadrid. Debutó el 28 de octubre de 1885 con la obra Sin familia, de Miguel Echegaray en el Teatro de la Comedia de Madrid.
Desde 1890, ya como primera actriz del Teatro Español, actuó en obras clásicas y de José Echegaray con gran éxito. Amplió estudios en París con el actor y director Benoît-Constant Coquelin en 1891. De vuelta a España, comenzó a trabajar en el Teatro de la Comedia. Más tarde, en 1894, regresó al Español.
Ese mismo año, abandona la compañía de Emilio Mario para crear la suya propia. Un año después coincide sobre ese escenario con la actriz Sarah Bernhardt interpretando en francés La esfinge.
Se casó el 10 de enero de 1896 con el actor Fernando Díaz de Mendoza, un aristócrata y Grande de España arruinado, con quien estableció su propia compañía teatral. En ella se integraron, a lo largo del tiempo, grandes nombres de la escena española del primer tercio del siglo xx: María Fernanda Ladrón de Guevara, Catalina Bárcena, María Cancio, Emilio Thuillier, Elena Salvador, Josefina Blanco, Emilio Mesejo, Felipe Carsi, Alfredo Cirera, Hortensia Gelabert, Pedro Codina, Luis Medrano...
Tras el nacimiento de sus dos hijos (Luis Fernando, 5 de marzo de 1897, y Carlos Fernando, 4 de septiembre de 1898), en 1899 emprendió una gira por Latinoamérica a la que siguió, un año después, otra por Francia, Bélgica e Italia. Repitió en sucesivos años giras por Latinoamérica (1908, 1910, 1914...), con especial querencia por Uruguay y Argentina. En la ciudad argentina de Córdoba, fue una de las inauguradoras del Teatro del Libertador San Martín (llamado en su época Teatro Rivera Indarte); en Buenos Aires inauguró el Teatro Avenida e hizo donativos para que se construyera el que es hoy llamado Teatro Nacional Cervantes. En 1925 actuó en la Manhattan Opera House de Nueva York.
A lo largo de su carrera estrenó, entre otras, obras de los Premio Nobel de Literatura Jacinto Benavente y José de Echegaray, así como de Benito Pérez Galdós, Eduardo Marquina, Valle-Inclán o los Hermanos Álvarez Quintero.
Existe un teatro en Madrid que lleva su nombre: el Teatro María Guerrero, llamado Teatro de la Princesa hasta 1931, del que María Guerrero había sido propietaria desde 1909 y donde llegó a fijar residencia desde 1918.
El María Guerrero es una sede del Centro Dramático Nacional. Luis Fernando contrajo matrimonio con María Guerrero López, sobrina de la actriz. Fue asimismo abuela de la actriz Mari Carmen Díaz de Mendoza, hija de Carlos y de la actriz Carmen Larrabeiti.
Falleció a consecuencia de un ataque de uremia, tan sólo siete días después de tener que suspender los ensayos del que habría sido su siguiente estreno: Doña Diabla, de Luis Fernández Ardavín. Está enterrada en el Cementerio de la Almudena de Madrid.